发光法测定酶的催化活性

发光法测定酶的催化活性，发光法应用荧光、磷光以及化学发光等作为检测器体系。活的生物体中观察的化学放 光称作生物体发光。生物体发光是由成为荧光素酶的酶类催化产生的，这类酶的底物即虫荧 光素，被转化为发光产物。

在发光法中，单位时间内反应体系发射的光子数目可以由特殊设 计的仪器——照度计来测量，这类仪器是以单光子探测器为基础的，通常是光电倍增管。 由来源于萤火虫的荧光素酶催化的反应就是一个例子，萤火虫荧光素4-单加氧酶（ATP 水解酶） ATP+D-虫荧光素+O2→氧合虫荧光素+AMP+pp+CO2+0.9hν 在该反应中，ATP 作为底物被消耗掉，光子在 562nm 的波长处发射。每摩尔的虫荧光 素的量子产量是0.9 爱因斯坦，也即消耗掉一分子ATP，大约发射1 个光子。因此该反应适 合用来测定ATP，从而测定那些能够催化ATP 消耗或者是ATP 生产的反应的那些酶。 为借助于萤火虫的生物发光来检测酶的活性，光强度必须在几分钟内呈线性增加，而且 必须严格正比于酶的催化活性。这些测定条件在测定肌酸激酶的催化活性时，已经得到了实 现。 磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP 其他依赖于NAD（P）的反应可以通过来源于发光细菌的生物发光来跟踪检测。

过氧化物酶(ＰＯＤ)活性的测定 —愈创木酚法

一、实验原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反 应，产物为醌类化合物。 实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。 在此酶存在下，H2O2 将愈创木酚氧化生成 茶褐色产物。此产物在470nm 有最大光吸 收，故可通过470nm处的吸光度变化测定过 氧化物酶的活性。

二、材料和设备

１、材料 ：马铃薯块茎 ２、仪器设备：751 型分光光度计、离心机、研 钵、25ml 容量瓶、量筒、试管、吸量管。 ３、试剂：0.05ml/L愈创木酚溶液， 0.05ml/L的磷酸缓冲液(pH5.5)， 2%H2O2， 0.1mol/L儿茶酚溶液， 20%三氯乙酸溶液

三、实验步骤

１、酶液的制备 取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放 入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀 浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g 水中离心10min，上清液转入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取２次，上 清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下 保存备用。 ２、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml 2%H2O2、 1.0ml 0.05mol/L 愈创木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加热5min的酶液为对 照，做二组重复实验。反应体系加入酶液 后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅 速转入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙 酸终止反应。然后，过滤(或5000g 离心 10min),滤液适当稀释，用751型分光光度 计在470nm波长下测定反应体系的吸光度。

四、实验结果

以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位 酶活力=——× D △A 0.01t 酶的比活力=——× D △A 0.01Wt 式中， △A为反应时间内吸光度的变化；W为马铃 薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数， 即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数 CAT过氧化氢酶活性测定方法 过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名 触酶(Catalase，CAT)，是一类以铁卟琳为 辅基的结合酶，由4个亚基组成，分子量为 240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧 化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生 的过氧化氢分解成H2O和02，避免了H202在体 内积累，从而可维持体内正常的活性氧水 平。是最早发现的与种子活力有关的氧化 酶类之一.

过氧化氢酶的应用： 被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含 过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡 后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。

近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该 酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳） 和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。

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